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間接ELISA實(shí)驗(yàn)原理及步驟

發(fā)布時(shí)間:2025-03-13     發(fā)布作者:上海通蔚生物

間接ELISA是一種常用的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),用于檢測(cè)特定抗體,例如在感染性疾病診斷中檢測(cè)針對(duì)特定病原體的抗體。它通過(guò)使用二抗來(lái)放大信號(hào),從而提高檢測(cè)的靈敏度。下面,我們將詳細(xì)介紹間接ELISA的原理和步驟。

 

間接ELISA原理

 

將純化的抗原包被在微孔板上。然后,加入待測(cè)樣本(例如血清),如果樣本中存在針對(duì)該抗原的特異性抗體(一抗),則一抗會(huì)與抗原結(jié)合。洗去未結(jié)合的一抗,以去除背景信號(hào)。接下來(lái),加入針對(duì)一抗物種的酶標(biāo)二抗,二抗會(huì)與結(jié)合在抗原上的一抗特異性結(jié)合。再次洗滌以去除未結(jié)合的二抗。最后,加入酶的底物,底物被酶催化產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào),例如顏色變化。通過(guò)測(cè)量信號(hào)的強(qiáng)度,可以定量或定性檢測(cè)樣本中目標(biāo)抗體的含量。

 間接elisa原理

間接ELISA步驟

 

步驟一:將已知抗原溶液加入到酶標(biāo)板孔中,在 37°C 孵育 1-2 小時(shí),或室溫孵育 2-4 小時(shí),使抗原吸附到酶標(biāo)板底部。最佳的孵育時(shí)間和溫度取決于所使用的抗原,可以參考自己試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行孵育。

 

步驟二:包被后,用洗滌液(例如 PBS-Tween 20)洗滌酶標(biāo)板 3-5 次,以去除未結(jié)合的抗原,用封閉緩沖液(如BSA或脫脂奶粉溶液)填充所有孔,封閉未結(jié)合的點(diǎn),以防止非特異性結(jié)合。封閉步驟有助于減少背景信號(hào),通常在室溫下孵育30分鐘至2小時(shí)或4℃過(guò)夜(孵育時(shí)間可以參考說(shuō)明書(shū)),封閉后,再次用洗滌液洗滌酶標(biāo)板 3-5 次,以去除多余的封閉液。

 

步驟三:封閉結(jié)束后,將待測(cè)樣本(如血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清等)用合適的稀釋液(例如 PBS-Tween 20)進(jìn)行稀釋。將稀釋后的樣本加入到相應(yīng)的孔中,同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。在 37°C 孵育 1-2 小時(shí),或室溫孵育 2-4 小時(shí),使抗體與包被的抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后,用洗滌液(例如 PBS-Tween 20)洗滌酶標(biāo)板 3-5 次,以去除未結(jié)合的抗體。

 

步驟四:完成樣本孵育后,用洗滌液(例如 PBS-Tween 20)洗滌酶標(biāo)板 3-5 次,以去除未結(jié)合的抗體和其他樣本成分。洗滌時(shí),將洗滌液注滿每個(gè)孔,靜置 1-2 分鐘后徹底倒掉,并輕拍酶標(biāo)板邊緣以去除殘留液體。重復(fù)此步驟 3-5 次,或根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整洗滌次數(shù)。也可以使用洗板機(jī)進(jìn)行洗滌。

 

步驟五、加入針對(duì)樣本中抗體(例如人IgG)的酶標(biāo)記的二抗,該二抗需特異性識(shí)別一抗的物種來(lái)源(例如兔)。例如,如果一抗是兔來(lái)源的抗體,則需要使用針對(duì)兔IgG的酶標(biāo)二抗。二抗會(huì)與結(jié)合在抗原上的一抗結(jié)合。在 37°C 孵育 1-2 小時(shí),或室溫孵育 2-4 小時(shí)。孵育結(jié)束后,用洗滌液(例如 PBS-Tween 20)洗滌酶標(biāo)板 3-5 次,以去除未結(jié)合的酶標(biāo)二抗。

 

步驟六:加入合適的底物溶液(如TMBOPD),酶標(biāo)二抗中的酶會(huì)催化底物產(chǎn)生顏色變化。顏色的深淺與樣本中抗體的量成正比。在顏色達(dá)到合適的深度后,加入終止液(例如硫酸或鹽酸)來(lái)停止顯色反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下(例如,TMB450 nm)讀取吸光度值。最后,根據(jù)吸光度值,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線或其他方法,可以定量或定性分析樣本中抗體的含量。

 

  以上就是間接ELISA的基本原理和步驟。理解這些原理和步驟對(duì)于成功進(jìn)行間接ELISA實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。間接ELISA是一種用途廣泛的技術(shù),可用于檢測(cè)各種抗體,并在傳染病診斷、免疫研究等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

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